東京医科歯科大学大学院 疾患生命科学研究部・生命情報科学教育

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難治疾患研究所 ゲノム応用医学研究部門 分子細胞遺伝分野

教授 稲澤譲治
准教授 井本逸勢
特任准教授 小崎健一
助教 横井左奈

http://www.tmd.ac.jp/mri/cgen/framepage.htm

研究内容

ゲノム情報を基盤に疾患の新しい診断、治療、予防法の開発、ならびに基礎研究で得られた成果を臨床医学に展開する「トランスレーションリサーチ」に多大な期待が寄せられている。私たちは、ゲノム構造変化、エピゲノム遺伝子制御機構、体系的遺伝子発現解析など統合的ゲノム解析研究を推進し、癌や遺伝疾患の原因遺伝子探索と病態の解明、さらにこれら難治疾患における画期的な診断、治療、予防法の開発を目指している。

研究紹介

特に疾患特異的ゲノム構造異常を標的にした疾患遺伝子の同定アプローチを体系化し、新規の癌や遺伝疾患の関連遺伝子を発見してきている。これらは癌個性診断のバイオマーカーとして、あるいは創薬の標的分子候補として注目されている。さらに、構想から6年の歳月を経て実用化した高精度・高密度のin-houseゲノムアレイを開発した。国際水準からも高精度のツールとしてMCGMolecular Cytogeneticsの略)アレイの呼称で認知されている。これらMCGアレイプラットフォームで展開するゲノム、エピゲノム解析は癌と遺伝疾患の病態解明に威力を発揮している。 

1.高精度ゲノムアレイの開発

従来、100キロベース(kb)〜数メガベース(Mb)レベルのゲノム構造異常を全染色体にわたり俯瞰的に検出する技術は存在しなかった。これを克服するものとして以下の1) 6) in-house CGHアレイを開発し、標準化した。その内訳は、1) 4523個のBACクローンを配置した全ゲノムをカバーする高密度アレイ(国立がんセ、細田、大木博士と共同研究)、2) 染色体1p3620Mbを間断なくカバーしたアレイ、3) 癌関連遺伝子800種類の解析を可能とする「がん個性診断」用アレイ、4) X染色体を1003個のBACで埋め尽くした高密度アレイ、5) 既知遺伝疾患、染色体異常症の診断アレイ、6) ヒトcopy number variationCNV)検出アレイである。特に3) Cancer Array-8005) MCG GDアレイを用いた診断システムを民間企業に技術移転し、癌ならびに遺伝診療の染色体検査の代替・補完検査技術として、既存特許を回避する新技術の開発と併せてその実用化が取り組まれている。2006年度からは、独立行政法人 新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)プロジェクト「個別化医療実現のための技術融合バイオ診断技術開発/染色体解析技術開発」プロジェクトに採択され、1) アレイデータ解析の専用ソフトの開発、2) 各種癌の基本ゲノム構造異常データベースの構築、3) 全自動解析装置等の開発研究を進めている。

 2.癌ゲノム構造異常の網羅的スクリーニング

1CGHデータベースの構築

25種類の癌種の総計1000例以上において標準CGH解析を実施し、データベースを構築し公開した。(2003729日に公開、CGH Data Base: http://www.cghtmd.jp/cghdatabase/index.html) 本データベースは米国NCBI統合データベースにおいて“CGH data base Japan”として紹介され世界中の癌ゲノム研究者に利用されている。20053月には、その内容を更新し、アクセス件数は22800件(2008/03/09 現在)を超えた。さらに、Cancer array-800による癌アレイCGH解析データを追加し、20083月に公開した。 

2)癌のゲノム・エピゲノム解析

多発性骨髄腫(MM):MM細胞株のアレイCGH解析で検出した11q23.1増幅領域から標的遺伝子候補POU2AF1を同定した。POU2AF1の強制発現はMM細胞株の増殖を亢進させ、ノックダウンは増殖を抑制した。プロモーターアッセイ、ChIPアッセイにより確認されたPOU2AF1の転写標的のTNFRSF17は、MM細胞株に対し増殖促進に働くことを見出した。臨床検体でもPOU2AF1増幅/発現亢進によりTNFRSF17も発現亢進していた。以上よりPOU2AF1MMにおいて発現亢進しTNFRSF17の転写誘導を介して腫瘍化に関与する、新規MM関連遺伝子であることが示唆された。(Zao et al., Oncogene 2007

卵巣癌:卵巣癌細胞株のアレイCGH解析で検出した6q23.2ホモ欠失の標的遺伝子がCTGFであることを明らかにした。CTGFはホモ欠失のない卵巣癌でも発現が低下しており、DNA脱メチル化処理で発現の回復を高頻度で卵巣癌細胞株(23株中12株)に認めた。プロモーター活性を示すCTGFCpGアイランド領域のメチル化は、細胞株、臨床検体ともに発現と逆相関が認められた。臨床検体では早期の癌でより発現が低下し、組織型でも発現の頻度に違いが認められた。CTGFを発現消失株で強制発現させると増殖抑制が認められ、発現株でノックダウンすると増殖の促進を認めたことから、CTGFDNAメチル化で卵巣癌の病期・組織型依存的に発現抑制を受ける癌抑制遺伝子であることが示唆された。(Kikuchi et al., Cancer Res 2007

神経芽腫(NB):我々グループにより開発されたBACアレイを用いたゲノムワイドDNAメチル化解析法のBAMCA法を用いてNBの網羅的メチル化解析から、N-myc増幅例や進行神経芽腫で高頻度に発現抑制をされている遺伝子prostaglandin D2 receptorPTGDR,  prostaglandin E receptor 2PTGER2)を見出した。PTGER2の強制発現はNB細胞株の増殖を抑制したが、その一部はPTGER2による細胞内cAMP増加によるアポトーシス誘導に起因することを明らかにした。PTGER2はエピゲノム異常や下流のシグナル伝達異常により活性が抑制される進行NBの癌抑制遺伝子候補と考えられた。(Sugino et al., Oncogene 2007

神経膠腫(GB):GBにおいて高頻度に検出する13qヘミ欠失の標的遺伝子探索を目的に、ゲノムワイドなmRNA発現ならびにゲノムコピー数異常解析を行い、その結果、高頻度に発現抑制を受ける遺伝子RGC32を同定した。RGC32の発現は進行度に相関し、かつp53の点突然変異依存的に低下した。p53刺激による発現誘導、プロモーターアッセイ、ChIPアッセイからRGC32p53の直接の転写標的であることを明らかにした。RGC32強制発現でGB細胞株の増殖は抑制された。間期に細胞質にあるRGC32は細胞分裂期には中心体に局在し、特にPLK1に結合しリン酸化により活性化されPLK1の分解を抑制することで細胞周期を負に制御する因子と考えられた。(Saigusa et al., Oncogene 2007

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図1 RGC32は、分裂期において中心体に局在する。

口腔癌(1):口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞株のアレイCGH解析で検出した10q12ホモ欠失領域内に座位し、高頻度に発現抑制されているPRTFDC1を見出した。PRTFDC1強制発現により細胞増殖抑制効果を、また、同遺伝子の発現抑制では細胞増殖の亢進が確認されたことから、新規癌抑制遺伝子であると考えられた。(Suzuki et al., Oncogene 2007

口腔癌(2):OSCC細胞株18株における157種のmiRNAの発現解析にDNAメチル化解析を組み合わせた絞り込み、ならびにOSCC外科切除検体11例の詳細な解析から、癌特異的DNA過剰メチル化によって発現抑制され、かつ癌抑制遺伝子活性を有するマイクロRNAmiR-137miR-193aを見出した。また、CDK6E2FmiR-137miR-193aの標的分子であることも明らかにした。(Kozaki et al., Cancer Res 2008

その他の癌(主に共同研究による

1) グリオーマの5p増幅の標的がSKP2であることを明らかにした。(Saigusa et al., Cancer Sci 2006

2) トポイソメラーゼⅡ阻害薬エトポシドによって惹起される染色体異常の生成機構を本学・発達小児・中田博士、水谷教授と共同で明らかにした。(Nakada et al., J Clin Invest 2005

3) 肝細胞癌、肺腺癌、神経内分泌性肺腫瘍のアレイ解析を国がんセ・柴田博士、廣橋総長と共同で実施した。(Katoh et al., gastroenterology 2007, Shibata  et al., Clin Can Res 2005, Peng et al., Cancer Sci 2005

4) 食道扁平上皮癌においてオーロラキナーゼ(Aurora-K)の発現亢進が遠隔リンパ節転移や予後不良を予測するバイオマーカーになることを京大・消化器外科・嶋田裕博士との共同研究で明らかにした。(Tanaka et al., Clin Can Res 2007

3.ゲノムアレイの応用技術開発

ポストシーケンス以降のゲノム研究であるENCODEEncyclopedia of DNA functional element)プロジェクトを視野に、現在、ゲノムアレイを解析のプラットフォームにした応用技術開発を進めている。

1.メチル化DNA領域の解析法BAMCAの開発

DNAメチル化領域のゲノムワイドスクリーニング法として、BACアレイ上でMCAmethylated CpG island amplification)法を展開するBAC array-based MCA methodBAMCA法)を確立した。(Inazawa et al., Cancer Sci, 2004, Review)現在、このBAMCA法により、口腔・食道扁平上皮癌をはじめとする各種の病型で癌特異的メチル化DNA領域のゲノムワイドスクリーニングを行い、幾つかの癌抑制遺伝子候補を同定している。

 

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2 BAMCA法による新規食道がん抑制遺伝子CRABP1の単離・同定

ABAMCA法により検出した15q25.1領域のメチル化異常.

B.食道がん臨床検体におけるCRABP1遺伝子のメチル化解析(Bisulfite sequencing.

C.食道がん臨床検体におけるCRABP1遺伝子の過剰メチル化と発現の関連性.

2.蛋白結合DNA領域の染色体ワイド検出法ChIP on BAC-arrayの開発

全ゲノムにおける蛋白コード領域はわずか2%以下である。約98%の蛋白非コード領域には、プロモーターやエンハンサー、さらに種を超えて保存されてCNEConserved Noncoding Element)などの時空間的転写調節ドメイン、あるいは100kbMbレベルの挿入/欠失多型(insertion/deletion polymorphism)の存在が明らかにされてきている。当研究室においてBACアレイとクロマチン免疫沈降法(ChIP)を組み合わせた“ChIP on BAC-array”法を確立し、癌や発生に関与する転写因子結合領域の染色体ワイド解析を進めている。既にE2F1の新規標的遺伝子を同定している。 

4.遺伝性疾患のゲノム解析

2005年より国内遺伝診療施設を備える20医療施設(旭川医大、北大、千葉大学、国立成育医療センター他)と連携し、「アレイCGH診断法実用化コンソーシアム」を形成し、当研究室で開発した染色体微細欠失異常検出ゲノムアレイ:Genome Disorder Array(通称GDアレイ)の遺伝診療検査としての実用化feasibility studyを実施している。これは、(1)医療におけるGDアレイの検出精度、有用性、実用性を確認すること、(2)新しい染色体微細欠失症候群の探索とその原因遺伝子の同定を目的とした取り組みである。また、厚生労働省精神・神経疾患研究委託費(18-5)「精神遅滞リサーチ・リソースの拡充と病因・病態解明をめざした遺伝学的研究」班 (主任研究者:後藤雄一先生)の分担研究として、家族性精神発達遅滞の原因となる潜在的ゲノムコピー数異常の探索を推進している。

最近、自作のXタイリングアレイにより、Schinzel-Giedion症候群と診断される患児においてXq22.3に約1.1Mbの微細重複を検出し、本重複にIL1RAPL2遺伝子の一部が含まれ、本疾患の病態形成に関与する可能性を示した。(Hayashi et al., Am J Med Genet 2007)また、非定型的Hunter症候群にXq28欠失を検出した。さらにtX;15)(q28;p11.2)転座を持つ別の発達遅滞症例のXq28切断点に微細欠失を同定し、両者でgenotype/phenotype correlationを検討した。その結果、両症例で共通するFMR2遺伝子の欠失が精神発達遅滞の原因となりうる可能性を示した。

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図3

A. Schinzel-Giedion症候群の患児に検出されたXq22.3の重複

B. FISHによる確認

C. 同領域に存在するIL1RAPL2遺伝子と重複範囲の模式図

 

トピックス

  1. 硬組織疾患ゲノムセンター:200541日より発足した硬組織疾患ゲノムセンターへは当教室から稲澤譲治(併任)、井本逸勢(併任)、小崎健一(特任准教授)がゲノム構造解析部門の中心メンバーとして参加し、本学の21世紀COEプログラム「歯と骨の分子破壊と再構築のフロンティア」と連携しつつ、歯学部 顎口腔外科(小村 教授)などとの共同研究を進めている。今年度は、系統的に収集した口腔がん症例のエピゲノム解析などによって、癌特異的過剰メチル化により発現抑制される複数の口腔がん抑制マイクロRNA遺伝子の単離・同定に成功するなど、着実な研究成果を挙げつつある。
  2. 田中浩司が第21 お茶の水会医科同窓会研究奨励賞を受賞した。
  3. 本田尚三が日本学生支援機構により特に優れた業績による返還免除の全額免除に認定された。
  4. 横井左奈が第15回黒住医学研究振興財団研究助成を受賞した。
  5. 林深(筆名:瀬川深)が第23回太宰治賞を受賞した。

業績目録

原著論文

  1. Kozaki K, Imoto I, Mogi S, Omura K, Inazawa J: Exploration of tumor-suppressive microRNAs silenced by DNA hypermethylation in oral cancer. Cancer Res.68:2094-2105, 2008
  2. Zhao C, Inoue J, Imoto I, Otsuki T, Iidab S, Ueda R, Inazawa J: POU2AF1, an amplification target at 11q23, promotes growth of multiple myeloma cells by directly regulating expression of a B-cell maturation factor, TNFRSF17. Oncogene. 271:63-75, 2008
  3. Kikuchi R, Tsuda H, Kanai Y, Kasamatsu T, Sengoku K, Hirohashi S, Inazawa J, Imoto I: Promoter hypermethylation contributes to frequent inactivation of a putative conditional  tumor suppressor gene connective tissue growth factor in ovarian cancer . Cancer Res. 67:15:7095-7105, 2007
  4. Suzuki E, Imoto I, Pimkhaokham A, Nakagawa T, Kamata N, Kozaki K,Amagasa T, Inazawa J: PRTFDC1, a possible tumor-suppressor gene, is frequently silenced in oral squamous-cell carcinomas by aberrant promoter hypermethylation. Oncogene. 2657:7921-32, 2007
  5. Sugino Y, Misawa A, Inoue J, Kitagawa M, Hosoi H, Sugimoto T, Imoto I, Inazawa J: Epigenetic silencing of prostaglandin E receptor 2PTGER2is associated with progression of neuroblastomas. Oncogene. 2653:7401-13, 2007
  6. Tanaka K, Imoto I, Inoue J, Kozaki K, Tsuda H, Shimada Y, Aiko S, Yoshizumi Y, Iwai T, Kawano T, Inazawa J: Frequent methylation-associated silencing of a candidate tumor-suppressor, CRABP1, in esophageal squamous-cell carcinoma. Oncogene.26: 6456-68, 2007
  7. Hayashi S, Honda S, Minaguchi M, Makita Y, Okamoto N, Kosaki R, Okuyama T, Imoto I, Mizutani S, Inazawa J: Construction of a high-density and high-resolution human chromosome X array for comparative genomic hybridization analysis. J Hum Genet 52:397-405, 2007
  8. Honda S, Hayashi S, Kato M, Niida Y, Hayasaka K, Okuyama T, Imoto I, Mizutani S, Inazawa J: Clinical and molecular cytogenetic characterization op two patients with non-mutational aberrations of the FMR2 gene. Am J Med Genet 143:687-93,2007
  9. Saigusa K, Imoto I, Tanikawa C, Aoyagi M, Ohno K, Nakamura Y, Inazawa J: RGC32, a novel p53-inducible gene, is located on centrosomes during mitosis and results in G2/M arrest. Oncogene 26:1110-21, 2007

 19編 

著書・総説

  1. 稲澤譲治、蒔田芳男、羽田 明編著:アレイCGH診断活用ガイドブック-知っておきたい染色体微細構造異常症-.医薬ジャーナル社 2008
  2. 井本逸勢、稲澤譲治:癌のゲノム一次構造異常解析とトランスレーショナルゲノミクス 細胞工学 269:1014-1019, 20072007/8/22

5編 

国際シンポジウム・招待講演等

  1. Inazawa J: Cancer genomic and epigenomic analyses on a BAC-array pratform. 7th AACR/JCA Joint International ConferenceHawaii, USA22/January/200721-25/January/2007

他3件 

国際学会

  1. Imoto I, Saigusa K, Tanikawa C, Aoyagi M, Ohno K, Nakamura Y, Inazawa J: RGC32, a novel p53-inducible tumor-suppressor gene, is located on centrosomes during mitosis and results in G2/M arrest. 98th annual meeting of American Association for CancerResearch 2007 LosAngeles, USA16/April/200714-18/April/2007
  2. Kozaki K, Imoto I, Inazawa J: MicoroRNA expression profiles in oral squamous cell carcinoma cell lines. 98th annual meeting of American Association for Cancer Research 2007 LosAngeles, USA17/ April/ 200714-18/April/2007
  3. Honda S, Hayashi S, Imoto I, Nakagawa E, Goto Y, Inazawa J:Exploration of genes related to X-linked mental retardationXLMRby MCGX-tiling array.57th Annual Meeting of the American Society of Human GeneticsSan Diego, CA24/October/200723-27/October/ 2007
  4. Hayashi S, Honda S, Imoto I, Inazawa J: Exploring cryptic genomic aberrations related to multiple congenital anomaly with mental retardation using in-house CGH-arrays. The American Society of Human Genetics 57th annual meetingSan Diego, CA25/October /200723-27/October/2007

他5件 

国内シンポジウム・招待講演等

  1. 稲澤譲治:がんのトランスレーショナルゲノミクス─Copy number variationCNV)と疾患−.第45回日本癌治療学会総会.国立京都国際会館.京都.20071025
  2. 井本逸勢、小崎健一、稲澤譲治:Cancer genomic and epigenomic analyses on BAC-array platform. 66回日本癌学会学術総会.パシフィコ横浜.2007105
  3. 井本逸勢、稲澤譲治: Cancer genomic and epigenomic analyses on a BAC-array platform. The Cancer Edition of H-Invitational meeting. 産業技術総合研究所.東京.200721

11件 

国内学会

  1. 林深、本田尚三、井本逸勢、稲澤譲治:アレイCGHによる先天異常症の潜在的染色体異常診断とその解析.日本人類遺伝学会第52回大会.京王プラザホテル.2007914
  2. 本田尚三、林深、井本逸勢、中川栄二、後藤雄一、稲澤譲治:X-tilling arrayを用いたX連鎖性精神発達遅滞(XLMR)の原因遺伝子探索.日本人類遺伝学会第52回大会.京王プラザホテル.2007915
  3. 横井左奈、井上純、井本逸勢、稲澤譲治:Long-range chromosomal interactions regulate the expression of novel E2F1 target gene. 66回日本癌学会学術総会.パシフィコ横浜.2007104
  4. 小崎健一、井本逸勢、茂木世紀、小村健、稲澤譲治:Identigication of tumor suppressor microRNA silenced by DNA methylation in oral squamous cell carcinoma.66回日本癌学会学術総会.パシフィコ横浜.2007105

12件 

主催セミナー

 

国際学術交流

研究助成金

他3件 

特許申請

1) 国内出願

他4件

2) 海外出願

[米国]

他2件

EP

 教育